Płynne biopsje do diagnozowania raka

Zazwyczaj guzy są badane za pomocą biopsji tkanek. Mała próbka jest pobierana z guza i genotypowana lub analizowana pod kątem budowy genetycznej. Problem z tym podejściem polega na tym, że guzy biopsyjne mogą stanowić wyzwanie. Co więcej, biopsja guza zapewnia jedynie migawkę guza.

Pisanie w Discovery Medicine w 2015 r. Labgaa i współautorzy podają następujące informacje na temat konwencjonalnej biopsji guza:

"Z oczywistych powodów trudno jest monitorować ewolucję nowotworu za pomocą kolejnych biopsji, a biopsja odzwierciedla tylko jedną plamkę guza i dlatego jest mało prawdopodobne, aby reprezentowała całe spektrum mutacji somatycznych w dużych guzach. biopsje dla tego samego guza, ale ta opcja wydaje się ani realistyczna, ani dokładna."

Biopsja płynna obejmuje pomiar krążącego DNA (ctDNA) i innych produktów ubocznych nowotworu w próbkach krwi pobranych od pacjentów z rakiem. To powstające podejście diagnostyczne będzie szybkie, nieinwazyjne i opłacalne.

Historia biopsji płynnej

W 1948 roku Mandel i Métais, para francuskich badaczy, po raz pierwszy zidentyfikowali ctDNA we krwi zdrowych ludzi. Odkrycie to wyprzedziło swój czas i dopiero kilka dziesięcioleci później badano ctDNA.

W 1977 r. Leon i współpracownicy po raz pierwszy zidentyfikowali zwiększone ilości ctDNA we krwi pacjentów chorych na raka. Do 1989 roku Stroun i jego współpracownicy zidentyfikowali charakterystykę nowotworową (tj. Raka) we krwi. Po tych odkryciach kilka innych grup zidentyfikowało określone mutacje w supresorach guza i onkogenach, niestabilność mikrosatelitarną i metylację DNA, które udowodniły, że ctDNA jest uwalniane do krążenia przez nowotwory.

Chociaż wiemy, że ctDNA pochodzące z komórek nowotworowych krąży we krwi, pochodzenie, szybkość uwalniania i mechanizm uwalniania tego DNA są niejasne, a wyniki badań są sprzeczne. Niektóre badania sugerują, że bardziej złośliwe nowotwory zawierają więcej martwych komórek nowotworowych i uwalniają więcej ctDNA. Jednak niektóre badania sugerują, że wszystkie komórki uwalniają ctDNA. Niemniej wydaje się prawdopodobne, że guzy nowotworowe uwalniają zwiększone poziomy ctDNA do krwi, co czyni ctDNA dobrym biomarkerem raka.

Z powodu dużej fragmentacji i niskich stężeń we krwi, ctDNA jest trudny do wyizolowania i analizy. Istnieje rozbieżność stężeń ctDNA między próbkami surowicy i osocza.Wydaje się, że surowica krwi zamiast osocza krwi jest lepszym źródłem ctDNA. W badaniu przeprowadzonym przez Umetaniego i współpracowników stwierdzono, że stężenia ctDNA są stale niskie w osoczu w porównaniu do surowicy z powodu możliwej utraty krążącego DNA podczas oczyszczania, ponieważ koagulacja i inne białka są eliminowane podczas przygotowywania próbki.

Według Heitzera i współpracowników, tutaj jest kilka konkretnych problemów, które należy rozwiązać, aby wykorzystać potencjał diagnostyczny ctDNA:

"Po pierwsze, procedury przedanalityczne muszą być standaryzowane … Wybór metody izolacji, która zapewnia ekstrakcję wystarczającej ilości DNA o wysokiej jakości jest krytyczny i wykazano, że czynniki przedanalityczne pobierania krwi i przetwarzania krwi mogą silnie wpływać na wydajność DNA …. Po drugie, jedną z najważniejszych kwestii jest brak harmonizacji metod kwantyfikacji, różne metody kwantyfikacji, … dają różne wyniki, ponieważ te pomiary są ukierunkowane na całkowite lub tylko wzmacnialne DNA … Po trzecie, mniej wiadomo o pochodzeniu i szczegółach mechanizm uwalniania ctDNA, aw większości badań zakłócających wydarzenia, które mogą również przyczynić się do uwolnienia ctDNA."

Ukierunkowane vs. nieukierunkowane podejścia

Obecnie istnieją dwa główne podejścia do analizy osocza krwi (lub surowicy) dla ctDNA. Pierwsze podejście jest ukierunkowane i szuka konkretnych zmian genetycznych wskazujących na nowotwory. Drugie podejście jest nieukierunkowane i obejmuje analizę obejmującą cały gen, w poszukiwaniu ctDNA odzwierciedlającego raka. Alternatywnie, sekwencjonowanie egzome zostało użyte jako bardziej opłacalne, nie ukierunkowane podejście. Exomy to fragmenty DNA, które są transkrybowane w celu wytworzenia białka.

Przy ukierunkowanych podejściach analizuje się surowicę pod kątem znanych mutacji genetycznych w małym zestawie mutacji kierowców. Mutacje kierowców odnoszą się do mutacji w genomie, które promują lub "napędzają" wzrost komórek nowotworowych. Mutacje te obejmują KRAS lub EGFR.

Ze względu na postęp technologiczny w ostatnich latach, możliwe stało się ukierunkowane podejście do analizy genomu dla niewielkich ilości ctDNA. Technologie te obejmują ARMS (system mutacji opornościowej amplifikacji); cyfrowy PCR (dPCR); kulki, emulsje, amplifikacja i magnetyki (BEAMing); i głębokie sekwencjonowanie (CAPP-Seq).

Pomimo postępów w technologii, które umożliwiają podejście celowane, ukierunkowane podejście dotyczy tylko kilku pozycji mutacji (punktów aktywnych) i pomija wiele mutacji kierujących, takich jak geny supresorowe nowotworów.

Główną korzyścią nie ukierunkowanego podejścia do biopsji płynnej jest to, że można je stosować u wszystkich pacjentów, ponieważ test nie polega na nawracających zmianach genetycznych. Nawracające zmiany genetyczne nie obejmują wszystkich nowotworów i nie są specyficznymi sygnaturami raka. Niemniej jednak w podejściu tym brakuje analitycznej wrażliwości, a kompleksowa analiza genomu nowotworu nie jest jeszcze możliwa.

Warto zauważyć, że cena sekwencjonowania całego genomu znacznie spadła. W 2006 r. Cena sekwencjonowania całego genomu wynosiła około 300 000 USD (USD). Do 2017 r. Koszt spadł do około 1000 USD (USD) na genom, w tym odczynników i amortyzacji maszyn do sekwencjonowania.

Clinical Utility of Liquid Biopsy

Początkowe wysiłki zmierzające do zastosowania ctDNA były diagnostyczne i porównywano poziomy u zdrowych pacjentów z tymi u pacjentów z rakiem lub z łagodną chorobą. Wyniki tych wysiłków były mieszane, a tylko niektóre badania wykazały znaczące różnice wskazujące na raka, stan bez choroby lub nawrót.

Powodem, dla którego ctDNA może być używany tylko przez pewien czas do diagnozowania raka, jest fakt, że zmienne ilości ctDNA pochodzą z guzów. Nie wszystkie nowotwory "zrzucają" DNA w tej samej ilości. Ogólnie rzecz biorąc, bardziej zaawansowane, rozpowszechnione guzy wyrzucają więcej DNA do krążenia niż wczesne, zlokalizowane nowotwory. Dodatkowo różne rodzaje nowotworów wydzielają różne ilości DNA do krążenia. Frakcja krążącego DNA pochodząca z nowotworu jest szeroko zmienna w badaniach i rodzajach raka, w zakresie od 0,01% do 93%. Należy zauważyć, że na ogół tylko niewielka część ctDNA pochodzi z guza, a reszta pochodzi z prawidłowych tkanek.

Krążący DNA może być użyty jako prognostyczny marker choroby. Krążące DNA może być wykorzystywane do monitorowania zmian nowotworowych w czasie. Na przykład jedno badanie wykazało, że dwuletni okres przeżycia u pacjentów z rakiem jelita grubego (tj. Liczba pacjentów wciąż żyjących co najmniej dwa lata po diagnozie z rakiem jelita grubego) i KRAS mutacje typu hotspot osiągały 100 procent u osób bez dowodów na obecność krążącego DNA. Co więcej, możliwe jest, że w niedalekiej przyszłości krążące DNA może być wykorzystywane do monitorowania zmian przedrakowych.

Krążący DNA można również wykorzystać do monitorowania odpowiedzi na leczenie. Ponieważ krążący DNA ma lepszy ogólny obraz genetycznego składu nowotworów, DNA prawdopodobnie zawiera DNA diagnostyczne, które można wykorzystać zamiast diagnostycznego DNA uzyskanego z samych nowotworów.

A teraz przyjrzyjmy się konkretnym przykładom biopsji płynów.

Guardant360

Guardant Health opracował test wykorzystujący sekwencjonowanie nowej generacji do profilowania krążącego DNA dla mutacji i rearanżacji chromosomowych dla 73 genów związanych z rakiem. Guardant Health opublikował badanie, w którym opisano przydatność biopsji płynów w onkologii. W badaniu wykorzystano próbki krwi od 15 000 pacjentów ze skojarzonymi 50 typami nowotworów.

W przeważającej części wyniki z testu biopsji płynnej odpowiadały zmianom genów obserwowanym w biopsjach guza.

Według NIH:

"Guardant360 zidentyfikował te same krytyczne mutacje w ważnych genach związanych z rakiem, takich jak EGFR, BRAF, KRAS, i PIK3CA przy częstotliwościach bardzo podobnych do wcześniej zidentyfikowanych w próbkach z biopsją guza, statystycznie korelujących z 94% do 99%."

Co więcej, według danych NIH naukowcy zgłosili następujące kwestie:

"W drugim komponencie badania naukowcy ocenili prawie 400 pacjentów - z których większość miała raka płuca lub jelita grubego - którzy mieli zarówno wyniki ctDNA krwi, jak i DNA tkanki nowotworowej i porównali wzorce zmian genomu. biopsja w porównaniu z wynikami z biopsji guza wynosiła 87%, a dokładność wzrosła do 98%, gdy próbki krwi i guza pobrano w ciągu 6 miesięcy od siebie."

Guardant360 był dokładny, mimo że poziomy krążącego DNA we krwi były niskie. Często krążące DNA nowotworowe stanowiło tylko 0,4% DNA we krwi.

Ogólnie rzecz biorąc, stosując biopsję płynną, badacze Guardant byli w stanie zidentyfikować markery nowotworowe, które mogłyby skierować leczenie przez lekarzy do 67 procent pacjentów. Ci pacjenci kwalifikowali się do leczenia zatwierdzonego przez FDA, a także do terapii badawczych.

ctDNA i rak płuc

W 2016 r. FDA zatwierdziła test mutacji w kobasie EGFR do wykrywania EGFR mutacje w krążącym DNA pacjentów z rakiem płuc. Ten test był pierwszą zatwierdzoną przez FDA biopsją płynną i zidentyfikowano pacjentów, którzy mogą być kandydatami do leczenia celowanymi terapiami z użyciem erlotynibu (Tarceva), afatynibu (Gilotrif) i gefitynibu (Iressa) jako leczenia pierwszego rzutu i osimeritinibu (Tagrisso) jako leczenie drugiego rzutu. Te ukierunkowane terapie atakują komórki nowotworowe specyficznie EGFR mutacje.

Co ważne, ze względu na dużą liczbę wyników fałszywie ujemnych, FDA zaleca pobranie próbki tkanki z biopsji od pacjenta, który ma negatywną biopsję płynów.

ctDNA i rak wątroby

Liczba osób umierających na raka wątroby wzrosła w ciągu ostatnich 20 lat. Obecnie rak wątroby jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów na raka na świecie. Nie ma dostępnych dobrych biomarkerów do wykrywania i analizy nowotworu wątroby lub komórek wątrobowych (HCC). Krążący DNA może być dobrym biomarkerem dla raka wątroby.

Rozważmy następujący cytat z Lagbaa i współautorów na temat możliwości zastosowania krążącego DNA do diagnozy raka wątroby:

"Hipermetylacja RASSF1A, p15 i p16 została zasugerowana jako wczesne narzędzie diagnostyczne w retrospektywnym badaniu obejmującym 50 pacjentów z HCC Poddano również testowi czterech nieprawidłowo zmetylowanych genów (APC, GSTP1, RASSF1A i SFRP1) pod kątem dokładności diagnostycznej, podczas gdy Metylacja RASSF1A została zgłoszona jako biomarker prognostyczny W późniejszych badaniach analizowano ctDNA u pacjentów z HCC przy użyciu technologii głębokiego sekwencjonowania … Uderzająco, nieprawidłowe liczby kopii DNA wykryto u dwóch nosicieli HBV bez wcześniejszej historii HCC w momencie pobierania krwi, ale który opracował HCC w czasie obserwacji.To odkrycie otworzyło drzwi do oceny zmiany liczby kopii w ctDNA jako narzędzie przesiewowe do wczesnego wykrywania HCC."

Słowo od DipHealth

Biopsje płynne to ekscytujące nowe podejście do diagnostyki genomicznej. Obecnie dostępne są niektóre biopsje płynne, które oferują wszechstronne profilowanie molekularne, w celu uzupełnienia informacji genetycznych uzyskanych z biopsji tkanek. Istnieją również niektóre biopsje płynne, które można wykorzystać zamiast biopsji tkanek - gdy biopsja tkanki jest niedostępna.

Ważne jest, aby pamiętać, że obecnie trwa wiele prób biopsji w stanie ciekłym i konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań w celu ulepszenia terapeutycznej użyteczności tej interwencji.